Un nuovo approccio più che raddoppia l’efficienza dell’editing delle cellule staminali

Un gruppo di ricercatori interdisciplinari guidati dalla Penn State ha sviluppato tecniche per migliorare l’efficienza di CRISPR-Cas9, la tecnica di editing del genoma che ha ottenuto il premio Nobel nel 2020. Sebbene la CRISPR-Cas9 sia più veloce, meno costosa e più accurata di altri metodi di editing genico, secondo il responsabile del progetto Xiaojun “Lance” Lian, professore associato di ingegneria biomedica e biologia alla Penn State, la tecnologia presenta dei limiti, soprattutto nelle applicazioni per migliorare la salute umana.

I ricercatori hanno sviluppato un processo più efficiente e accessibile per applicare i sistemi CRISPR-Cas9 nelle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), derivate da linee di cellule staminali approvate a livello federale, che secondo Lian potrebbe far progredire notevolmente la diagnostica e i trattamenti per le malattie genetiche. L’approccio è stato pubblicato il 7 settembre in Cell Reports Methods.

CRISPR-Cas9, acronimo di clustered regularly interspaced short palindromic repeats e CRISPR-associated protein 9, offre agli scienziati la possibilità di indirizzare posizioni precise del codice genetico per modificare il DNA, offrendo l’opportunità di creare nuovi strumenti diagnostici e potenzialmente correggere le mutazioni per trattare le cause genetiche delle malattie.

“Il genoma umano è enorme e CRISPR-Cas9 permette agli scienziati di trovare e indirizzare un gene mutato per studiarlo”, ha detto Lian.

CRISPR utilizza un disco di materiale genetico, noto come DNA plasmidico, per fornire acido ribonucleico (RNA) guidato che posiziona l’enzima Cas9 nella posizione precisa del gene bersaglio. Una volta individuato il DNA, Cas9 si lega ad esso e lo taglia, permettendo ad altro DNA di riparare il taglio. I ricercatori possono quindi vedere come la rimozione modifica l’espressione del gene. Secondo Lian, però, gli attuali metodi CRISPR basati sul DNA presentano problemi di consegna e di efficienza di editing.

“La consegna degli effettori CRISPR a DNA è bassa”, ha detto. “Quando si utilizza CRISPR, solo il 20-30% delle cellule bersaglio riceve il DNA di editing genico. Il trasporto di RNA nelle cellule può essere più efficiente; tuttavia, quando viene introdotto un normale RNA, le cellule possono vederlo come un virus. Distruggono l’RNA prima che possa produrre proteine – ad esempio, nel giro di poche ore – e, così facendo, distruggono il tentativo di editing genico”.

Per migliorare il risultato, i ricercatori hanno cambiato il modo in cui gli strumenti di editing del genoma vengono consegnati alle cellule staminali, utilizzando un RNA modificato (modRNA). Il modRNA si differenzia dal DNA plasmidico perché sostituisce uno dei substrati di base presenti nell’RNA con una versione chimicamente modificata ed è stabilizzato da un supporto strutturale più forte.

“Il modRNA è risultato notevolmente più efficiente del DNA plasmidico”, ha detto Lian. “Circa il 90% delle cellule ha ricevuto il modRNA da una semplice trasfezione, quindi è stato in grado di rimanere al suo posto e di svolgere il suo lavoro”.

I ricercatori hanno anche scoperto che il tempo di permanenza del modRNA era ideale: abbastanza a lungo da modificare le cellule, ma non così a lungo da causare attività fuori bersaglio. Ma il modRNA ha introdotto un altro problema, secondo Lian.

Quando il modRNA Cas9 viene consegnato con successo al gene bersaglio, crea una rottura a doppio filamento nel genoma, che alcune cellule cercheranno di riparare. Quelle che si correggono da sole possono trasmettere la riparazione, o “mutazione”, alla loro progenie. Questo è il processo che i ricercatori vogliono capire meglio, quindi queste sono le cellule che vogliono raccogliere e studiare. Il problema, ha detto Lian, è che la maggior parte delle cellule con questa rottura la identificano come un problema importante del genoma e si autodistruggono invece di cercare di ripararsi.

Per ridurre gli effetti collaterali tossici di Cas9 e aiutare le cellule modificate a sopravvivere, il team di Lian ha introdotto una piccola proteina nota per aiutare le cellule a crescere. Secondo Lian, questa proteina aggiunta ha inibito la morte cellulare e migliorato l’efficienza dell’editing Cas9 fino all’84%.

I ricercatori hanno anche scoperto che il modRNA potrebbe migliorare altre tecniche di editing genico, come l’editing delle basi. L’editing delle basi può eliminare i geni o correggere le mutazioni nel genoma utilizzando una proteina per cambiare un singolo nucleotide invece di tagliare entrambi i filamenti, come fa CRISPR.

“Abbiamo trasfettato le cellule staminali con una proteina di base editing a base di plasmidi o di modRNA”, ha detto Lian. “Il nostro metodo basato sul modRNA è stato più di quattro volte più efficiente, con il 68%, rispetto alla tecnica basata sul plasmide, con circa il 16%, nell’editing del genoma”.

Secondo Lian, se un maggior numero di laboratori di editing genico migliorerà l’efficienza e l’efficacia, i ricercatori saranno in grado di comprendere meglio i geni e le loro funzioni in tempi più brevi.

“Il corpo umano ha più di 20.000 geni, ma ne studiamo le funzioni solo per circa il 10%”, ha detto Lian. “Esaminare lo scopo di ogni gene rimanente, uno alla volta, potrebbe richiedere una vita intera. L’uso di cellule staminali ingegnerizzate con le nostre tecniche di editing genico altamente efficienti può accelerare notevolmente questo processo”.

A questo lavoro hanno contribuito il professor Jian Yang e i dottorandi Tahir Haideri, Alessandro Howells e Yuqian Jiang, tutti del Dipartimento di Ingegneria Biomedica della Penn State, nonché Xiaoping Bao della Purdue University. Lian e Yang sono affiliati all’Huck Institutes of the Life Sciences. Lian è anche affiliato al Dipartimento di Biologia della Penn State.

La National Science Foundation, i National Institutes of Health e la Penn State hanno sostenuto questo lavoro.